芦丁(Rutin),面法又名芸香苷,优化属于多羟基黄酮类化合物,槐米具有抗炎、中芦抗病毒、溶剂热法抗肿瘤、工艺降血脂等多种药理作用,面法在临床上主要用于治疗高血压、优化糖尿病、槐米心血管疾病等多种疾病。中芦此外,溶剂热法芦丁还作为原料被应用于医药、工艺保健品和化妆品行业,面法是优化一种极具开发潜力的天然活性物质。芦丁广泛存在于槐米、槐米桑叶、苦荞麦、小蓟等植物中,其中槐米中的含量较为丰富,是工业提取芦丁的主要原料。
槐米(Flossophorae),豆科植物槐树(SophorajaponicaL.)的干燥花蕾及花。在中医临床上作为止血剂,用来治疗痔疮、子宫出血,并有清肝泻火、治疗肝热目赤的功效。目前从槐米中提取芦丁的方法主要有碱溶酸沉法、醇回流法、微波法和超声法,但这些提取方法存在一定的不足之处,如碱提酸沉法提取率低;醇回流法提取时间长;微波法和超声法使用的超声发生器和微波仪价格昂贵,提取成本较高。因此,探寻一种新的高效、快速、便捷的提取方法就显得尤为重要。
溶剂热法是纳米材料和功能材料合成的常用方法,其主要原理是以有机物或有机物的水溶液为反应溶剂,通过调控反应温度,使密闭体系内的压力升高,从而使得溶剂在高于正常溶剂沸点温度的情况下仍保持液体状态,但其物理化学性质,如,表面张力、极性、氢键等发生改变,进而提高反应速度和产物提取率。目前尚未见应用溶剂热法提取芦丁的文献报道,因此本试验对该提取方法进行了研究,并采用响应面法对该法进行了优选,以期为芦丁的提取提供一种新方法,同时也为槐米的深度开发提供参考。
一、材料与方法
1、材料与仪器
槐米(洛阳中药材市场,粉碎过80目筛,备用);冰乙酸(分析纯),天津市科密欧化学试剂有限公司;芦丁对照品,大连美仑生物技术有限公司;甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;水为超纯水。天美LC2000液相色谱仪,上海天美科学仪器有限公司;CT14RD高速离心机,上海天美生化仪器设备有限公司;BT125D双量程电子分析天平,德国多利斯公司;聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜,福建物质结构研究所;PHG9246A电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司。
2、试验方法
(1)色谱条件
色谱柱:KromasilC18柱子(250×4.6mm,5μm),流动相:甲醇-水-冰乙酸(46∶52∶2,v/v);流速:1mL/min;检测波长:360nm;进样量:20μL;柱温:室温。
(2)芦丁标准曲线的绘制
精密称取芦丁对照品10.0mg,50%甲醇溶液定容于200mL容量瓶中,移取芦丁对照品溶液5mL、10mL、15mL、20mL、25mL分别置于100mL容量瓶中,50%甲醇定容。按照色谱柱:KromasilC18柱子(250×4.6mm,5μm),流动相:甲醇-水-冰乙酸(46∶52∶2,v/v);流速:1mL/min;检测波长:360nm;进样量:20μL;柱温:室温色谱条件进样,采用峰面积外标法绘制芦丁浓度(X)与峰面积(Y)的回归方程。
(3)单因素试验
称取槐米0.20g,置于25mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,加入一定浓度的乙醇溶剂,在设定的条件下(考察乙醇浓度、提取时间、提取温度、液料比)进行提取。提取结束后,自然冷却至室温。移取2.0mL提取液以8,000r/min离心3min,取上清液0.5mL于100mL容量瓶中,50%甲醇定容,摇匀,过0.45μm滤膜,取续滤液作为供试液。检测芦丁含量,按下式计算样品中芦丁的提取率Y。
芦丁提取率Y(%)=C×V×n/104M;
式中C为提取液中芦丁浓度(μg/mL),V为提取溶剂的体积(mL),n为稀释倍数,M为槐米质量(g)。
(4)响应面试验设计
在单因素试验基础上,依据Design-Expert8.0.6.1软件中的CentralComposite设计原理,选乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取温度(C)和液料比(D)为4个考察因素,芦丁提取率(Y)为响应值,进行四因素五水平的试验设计,以确定槐米中芦丁最佳提取工艺条件。因素水平表见表1。
二、结果与分析
1、芦丁含量的测定
图1是芦丁标准品和样品的高效液相谱图。从图中可以看出,在以上色谱条件下,芦丁峰形对称,可用于溶液中芦丁含量的测定。同时,以峰面积为纵坐标(Y),芦丁浓度为横坐标(X),得到芦丁的标准曲线方程为:Y=32120X-12042,R2=0.9993。芦丁浓度在2.5~12.5μg/mL范围内线性关系良好。
2、单因素试验分析
(1)乙醇浓度
称取0.20g的槐米粉末5份,分别加入水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和乙醇16mL于聚四氟乙烯的反应釜内,90℃提取30min,结果见图2。从图中可以看出,乙醇浓度低于50%时,随着乙醇浓度的升高,芦丁提取率随之升高。原因可能是由于乙醇的渗透能力较强,增加乙醇浓度提高了芦丁在提取溶剂与细胞基质之间的溶解平衡,所以乙醇浓度升高有利于芦丁的提取。但芦丁的极性较大,继续提高乙醇浓度,溶剂的极性变小,根据相似相溶原理,芦丁的溶解度会随之变小,因此芦丁的提取率降低。因此,选择乙醇溶度为50%较为适宜。
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