ROS主要来源于损伤的线粒体,当细胞内产生过量的蓟茎经细ROS或体内氧化剂含量超过细胞的抗氧化应答能力时,细胞就会产生氧化应激。叶中本试验以DCFH-DA作为荧光探针,脂溶作用检测2’,性提7’-二氯荧光素(DCF)的取物荧光强度即可获知细胞内ROS的水平。与空白对照组相比,对神90μmol/LH202处理PCI2细胞4h后,胞的保护细胞内ROS水平显著增加(P<0.01),朝鲜达到460.43%(图4a),蓟茎经细使细胞产生严重的叶中氧化损伤;经脂溶性提取物预处理后,能够显著地抑制PCI2细胞内ROS的脂溶作用产生(P<0.01),其中2mg/L脂溶性提取物预处理细胞8h后,性提ROS含量为208.37%。取物荧光显微镜观察染色后的对神PCI2细胞发现,细胞呈现的荧光强度变化与细胞内ROS水平变化趋势一致(图4b)。因此,脂溶性提取物可以有效地清除ROS,缓解H202引发的线粒体功能障碍。
当动物或植物体产生氧化应激时,会发生脂质氧化,而MDA是一种生物体脂质氧化的天然产物,可以用来确定脂质氧化水平。与空白对照组相比,90μmol/LH202处理PCI2细胞4h后,MDA含量显著增多(P<0.01),达到192.98%(图5);经脂溶性提取物预处理8h后,能够显著地阻止MDA的产生(P<0.01);而正常细胞经脂溶性提取物处理后,在无H202伤害的情况下,其MDA含量可降低至25.71%。
为了进一步探究脂溶性提取物能否有效地抑制细胞凋亡,利用AnnexinV-FITC/PI进行染色,经流式细胞术检测细胞凋亡率(图6a)。如图6b所示,与空白对照组(8.14%)相比,H202处理显著增加了细胞凋亡率(23.66%),经朝鲜蓟脂溶性提取物预处理后,PCI2细胞的凋亡得到显著抑制。其中,经过2mg/L脂溶性提取物预保护后,细胞凋亡率降低至8.75%。
为了更加直观地比较不同处理组的细胞凋亡情况,利用A0-EB对细胞进行染色,通过荧光显微镜观察细胞形态。如图6c所示,空白对照组的细胞因为吖啶橙(A0)透过其完整的细胞膜嵌入DNA,几乎全部呈现绿色荧光,细胞形态正常。没有明显的凋亡相关形态学改变;经H202处理的模型组的细胞发生了边缘化、核凝集等发绿色荧光的早期凋亡现象,并且因为溴化乙锭(EB)透过其破损的细胞膜嵌入DNA,呈现出橘黄色荧光的晚期凋亡现象:而经过朝鲜蓟脂溶性提取物预处理的PCI2细胞呈现出早期凋亡和晚期凋亡细胞皆有减少的现象,并呈现质量浓度依赖性。
本试验探究了朝鲜蓟副产物中脂溶性提取物对PCI2神经细胞的保护作用。利用GC-MS对朝鲜蓟副产物中萜类及甾醇类化合物进行定性与定量分析,结果表明,主要含有3种倍半萜内脂,2种甾醇及8种五环三萜。试验以H202作为氧化损伤诱导剂,探究朝鲜蓟副产物脂溶性提取物的生理活性,发现该提取物可降低PCI2神经细胞的氧化损伤,并且伴随细胞内LDH漏出率、MDA含量及ROS水平的降低。经过AnnexinV-FITC/PI双染及A0-EB双染后发现,经脂溶性提取物处理的PCI2细胞凋亡率显著降低,与荧光显微镜的观察结果一致。综上,朝鲜蓟副产物脂溶性提取物对PCI2神经细胞具有抗凋亡及保护作用,值得进一步的开发利用与研究。
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